細(xì)胞分離液,GE貨號17-0891-01?
1、在溫和的條件下，分離細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和較大的病毒分子(可小至~70S)，保持其存活和形態(tài)的完整性
2、對細(xì)胞無毒性
3、可調(diào)整到生理狀態(tài)下的離子強(qiáng)度和pH
4、使用角轉(zhuǎn)頭，以中速離心，即可形成梯度
5、等滲梯度，密度zui大可達(dá)到1.3 g/ml。
細(xì)胞分離液,GE貨號17-0891-01?
操作方法及注意事項(xiàng)
1.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。
Percoll濃度(％) 70 60 50 40 30 20
比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
2.不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時(shí)相鄰兩層Percoll比重相差不大時(shí)，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。
3.裝樣：樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過大，細(xì)胞濃度也不可過高，否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。
4.離心：一般采用離心力為400g，時(shí)間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時(shí)要慢，要平穩(wěn)。
5.取樣：當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時(shí)，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞;有時(shí)大部分細(xì)胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測用。
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分離純化細(xì)胞舉例
1.富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml試管(或塑料管)分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從外周血中分離的PBMC細(xì)胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細(xì)胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
2.純化淋巴母細(xì)胞和除去si細(xì)胞：分別疊加50％和30％Percoll液。收取經(jīng)PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者)，按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細(xì)胞為小淋巴細(xì)胞；兩層Percoll之間為淋巴母細(xì)胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細(xì)胞。收獲淋巴母細(xì)胞可進(jìn)行表型、結(jié)構(gòu)以及功能的研究。
