維生素D簡介
維生素D(Vitamin D, VD)是維持人體健康必不可少的一類脂溶性維生素，具有促進腸道對鈣、鎂和磷酸鹽的吸收，調(diào)節(jié)機體免疫功能等多種生物功效。維生素D家族兩大重要成員是維生素D3(膽鈣化醇)和維生素D2(麥角鈣化醇)，它們合稱為鈣化醇。為了預(yù)防和治療維生素D缺乏，市場上有多種維生素D或復(fù)方滴劑供消費者選擇。
藥典0722維生素D測定第四法
2020版《中國藥典》四部通則《0722 維生素D測定方法》中采用高效液相色譜法測定維生素D及其制劑、維生素AD制劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D經(jīng)折算成維生素D的總量。在2015版基礎(chǔ)上，2020版藥典新增了第四法。該法采用正相二維液相色譜，供試品無需經(jīng)過復(fù)雜處理即可進樣分析，大大節(jié)省了樣品前處理的時間。第四法一維色譜柱藥典委推薦采用以脲基鍵合硅膠為填充劑(2.1mm × 150mm, 3um)，該規(guī)格與賽默飛 Acclaim系列的HILIC-10色譜柱一致。其實，早在2010年左右，賽默飛液相團隊就已經(jīng)向相關(guān)食品藥品檢驗院所推薦該色譜柱，共同探討研究采用二維液相色譜技術(shù)測定維生素D的方案，并結(jié)合賽默飛獨有的雙三元液相色譜儀器開展相關(guān)實驗。
圖1.雙三元二維液相系統(tǒng)連接示意圖
賽默飛特色雙三元液相
賽默飛雙三元液相早在2006年就已在市場推出，一經(jīng)推出便得到行業(yè)內(nèi)一致好評，并獲得當年匹茲堡金獎。其采用獨特的雙泵設(shè)計，每一個泵都可以獨立工作，有各自獨立的流動相比例閥和流動相進出系統(tǒng)，可以同時單獨控制三種不同的流動相來進行復(fù)雜的樣品分析。柱溫箱部分放置的兩個切換閥可以通過變色龍軟件的控制在相應(yīng)的時間進行閥切換，實現(xiàn)流動相流路和色譜柱連接的不同組合切換。因此使用雙三元液相可以輕松實現(xiàn)2020版《中國藥典》維生素D測定第四法。
VC雙三元液相色譜條件
Vanquish™ Core(簡稱VC)雙三元液相采用模塊化設(shè)計，耐壓達700bar，可以兼顧常規(guī)液相及部分超高效液相工作。結(jié)合配套的正相套件，即可實現(xiàn)正相體系的使用。本實驗詳細條件如表1所示。
表1. 雙三元二維液相色譜條件
實驗結(jié)果
維生素D3校正因子f1對照品溶液和校正因子f2混合對照品溶液及供試品配置步驟參考藥典通則0722 維生素D測定法，實驗結(jié)果如下：
圖2.f2混合對照品溶液一維色譜圖(上)和二維色譜圖(下)
表2. f2混合對照品溶液一維色譜結(jié)果
由圖2及表2可見，采用雙三元液相色譜測定維生素D，前維生素D和維生素D的分離度良好，可已達到9.3，滿足藥典分離度大于5的要求；兩個峰的理論塔板數(shù)分別為9568及8798，均遠大于藥典要求的2300。
圖3. 某維生素D滴劑供試品一維色譜圖(上)和二維色譜圖(下)
圖3顯示該維生素D滴劑供試品一維色譜中，前維生素D 受基質(zhì)干擾，與干擾峰分離度不佳，維生素D的峰形較寬。經(jīng)過二維色譜后，前維生素D與干擾峰達到分離，兩個目標峰的峰形收窄，更利于維生素D的定量。
圖4. f2混合對照品溶液連續(xù)進樣5針疊加圖(上圖為一維，下圖為二維)
實驗對方法的重復(fù)性做了考察，結(jié)果顯示連續(xù)進樣5針，一維前維生素D及維生素D的保留時間RSD分別為0.88%及0.42%，峰面積RSD分別為1.42%及0.96%；二維前維生素D及維生素D的保留時間RSD分別為0.88%及0.42%，峰面積RSD分別為1.21%及0.80%，充分體現(xiàn)了雙三元液相兩泵的優(yōu)良性能及整個液相系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
小結(jié)
隨著2020版藥典四部通則0512高效液相色譜法中引入了多維液相色譜(單中心切割、多中心切割和全二維色譜)的介紹，市場對于二維色譜的認知及了解逐漸廣泛，也涌現(xiàn)出越來越多二維液相方法，賽默飛特色的雙三元液相完全滿足各行各業(yè)用戶二維液相色譜的需求。除二維液相色譜應(yīng)用外，賽默飛雙三元液相色譜儀同樣被廣泛應(yīng)用于液質(zhì)聯(lián)用在線除鹽，Online-SPE(在線固相萃取)，串聯(lián)及并聯(lián)液相以及特色電霧式檢測器CAD反梯度補償等高級應(yīng)用，為廣大企業(yè)用戶降本增效。
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