母乳被公認為是嬰兒最理想的食物，最佳的營養來源，母乳已經檢測出至少含有400多種營養物質，其中的母乳低聚糖（HMOs）是人類母乳中的第三大固體組分，僅次于乳糖（55-70g/L）和脂肪（15-40g/L）， HMOs 是一類包含 200 多種不易消化且非營養性的低聚糖混合物，其具有重要的生物學功能，不僅對腸道病原微生物起到抗感染的作用，還能維持腸道微生態的平衡，更有利于嬰兒神經系統發育，并可降低免疫相關的非傳染性疾病的發生。目前嬰幼兒配方奶粉主要是用動物的乳為原料，特別是牛乳，而牛乳中HMOs的含量非常少，所以在配方奶粉中添加HMOs就非常有必要，這樣可以最大限度地減少配方奶粉喂養和母乳喂養嬰兒之間的發育差異，從而可能改善配方奶粉喂養嬰兒的整體健康狀況。而隨著國內監管機構的公示和批準， HMOs現已被正式允許用于國內嬰幼兒配方奶粉，含有HMOs的嬰幼兒配方奶粉也陸續開始上市銷售。
國家衛健委于2023年10月7日發布公告，正式批準母乳低聚糖（HMOs）中的2´-FL（2´-巖藻糖基乳糖）和LNnT（乳糖-N-新四糖）可作為食品營養強化劑應用于嬰幼兒配方奶粉、調制乳粉（兒童用)，以及特殊醫學嬰兒食品[1]。國家食品安全風險評估中心于2024年3月13日發布，擬征求意見的食品營養強化劑新品種中，涉及3´-SL（3´-唾液酸乳糖鈉鹽）和6´-SL（6´-唾液酸乳糖鈉鹽）均屬于HMOs[2]。這些品種原料的檢測方法均涉及電霧式檢測器（CAD）。
圖：CAD檢測器（左：Corona Veo 系列，右：Vanquish CAD系列）
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乳糖-N-新四糖CAD測定結果
1.1 依據公告文件方法，完成系統適應性測試，溶劑連續進樣至少五次，待液相色譜響應穩定后在電霧式檢測器條件下進行系統適用性測試。滿足下表條件后可進行乳糖-N-新四糖及乳糖-N-新四糖果糖異構體含量測試，測定結果均可滿足系統適應性要求，結果見下表所示。
表1. 系統適用性要求及測試結果
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1.2校正曲線測定結果
乳糖-N-新四糖通過紫外檢測器測定，其線性校正曲線結果如下圖所示，從結果可知，乳糖-N-新四糖在160-240µg/mL濃度范圍內，強制過零點，通過一次線性擬合，結果良好，相關系數R2為0.99941，滿足＞0.995要求。
乳糖-N-新四糖果糖異構體通過CAD檢測器測定，其線性校正曲線結果如下圖所示，從結果可知，乳糖-N-新四糖果糖異構體在6-100µg/mL濃度范圍內，通過二次線性擬合，結果良好，相關系數R2為0.99996。
圖 乳糖-N-新四糖校正曲線
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圖 乳糖-N-新四糖果糖異構體校準曲線
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1.3定量限測定結果
對乳糖-N-新四糖果糖異構體的定量限進行考察，結果為6.0µg/mL。按標準中樣品濃度0.2 mg/mL計算，乳糖-N-新四糖果糖異構體的檢出濃度可達0.3%，高于當前標準公示1.0%限度要求，完全滿足原料質控的需求。
1.4實際樣品分析測定結果
運用本文方法，串聯紫外檢測器和CAD檢測器，完全可以滿足對不同批次營養強化劑乳糖-N-新四糖原料中乳糖-N-新四糖（紫外測定）和乳糖-N-新四糖果糖異構體（CAD測定）的含量同時測定的需求，乳糖-N-新四糖果糖異構體CAD結果和乳糖-N-新四糖紫外結果如下圖所示。
圖 原料中乳糖-N-新四糖果糖異構體測定結果（CAD）
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圖 原料中乳糖-N-新四糖測定結果（UV）
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2´-巖藻糖基乳糖原料CAD測定結果
依據公示方法，通過CAD檢測器及對應色譜方法，測定結果下圖所示，可滿足原料中2´-巖藻糖基乳糖原料中的D-乳糖和二巖藻糖基乳糖含量測定質控的需求。
圖 2’巖藻糖基乳糖樣品色譜圖
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3´-唾液酸乳糖鈉鹽&6´-唾液酸乳糖鈉鹽CAD測定結果
依據公示方法，通過CAD檢測器及對應色譜方法，結果如下圖所示，本方法適用于原料中3´-唾液酸乳糖鈉鹽及異構體3´-唾液酸乳果糖，6´-唾液酸乳糖鈉鹽和乳糖含量同時測定質控的需求。
圖 乳糖、3´-唾液酸乳糖鈉鹽&6´-唾液酸乳糖鈉鹽標品色譜圖（點擊查看大圖）
Summary
小結
通過紫外檢測器串聯電霧式檢測器（CAD）成功復現了母乳低聚糖中LNnT(乳糖-N-新四糖)當前公示的國家標準方法。雖然待測物沒有明顯的紫外吸收，但對于原料中含量較高的主成分，公示方法采用紫外檢測器末端吸收205nm進行測定，效果較為理想；而對于需要重點控制的主要雜質乳糖-N-新四糖果糖異構體，由于限度較低，公示標準采用了更加靈敏的CAD檢測器進行分析，方法學考察結果顯示，靈敏度和重現性均符合標準要求。
基于CAD檢測器對無/弱紫外吸收物質檢測的優勢，其他類型的母乳低聚糖，如2´-FL（2´-巖藻糖基乳糖）、3´-SL（3´-唾液酸乳糖鈉鹽）及6´-SL（6´-唾液酸乳糖鈉鹽），也同樣適用。同時，本方法也可用于嬰幼兒配方奶粉、調制乳粉(兒童用)以及特殊醫學嬰兒食品中LNnT含量的測試，可作為相關行業分析人員進行該領域分析的重要參考。
參考文獻：
[1] 《關于桃膠等15種“三新食品”的公告》（2023年第8號），國家衛生健康委，2023年9月22日.
[2] 關于公開征求羥基酪醇等7種食品添加劑新品種意見，國家食品安全風險評估中心，2024年3月13日.
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